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  • 郭天南:全景式組學研究為新冠重癥早診斷提供決策依據

    2020年6月29日 08:46:31 來源: 分析測試百科
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      分析測試百科網訊 在新冠肺炎COVID-19疫情肆虐全球之際,PCR技術在快速篩查中已大顯神威,但進入臨床后如何更早地區分輕癥和重癥患者,從而更準確地治療和用藥?5月27日中國研究人員在《Cell》發表文章,利用蛋白質組學和代謝組學的全景式分析,發現了重癥患者體內應對病毒進攻特征性的分子改變,并結合機器學習篩選出COVID-19重癥患者特征性的22個蛋白質和7個代謝物,有望為臨床醫生提供有指導意義的診斷和治療線索。這項研究的一位主要參與者是西湖大學生命科學學院的特聘研究員郭天南博士。分析測試百科網小編近日采訪到郭天南博士,他將分享一個蛋白質組學研究者對于COVID-19及各類挑戰性難題的探索,追溯蛋白質組學發展的歷程,展望蛋白質組學的未來,期望為組學研究者、為正在攻克新冠病毒、腫瘤等人類科學和臨床難題的讀者們帶來啟示。

    西湖大學 郭天南特聘研究員

    《Cell》:COVID-19重癥患者血清特征性分子改變

      目前,臨床上評估COVID-19重癥患者的依據,主要是根據臨床特征進行經驗性診斷,如呼吸頻率(≥30次/min)、平均血氧飽和度(靜息狀態下≤93%)或動脈血氧分壓/氧濃度(≤300 mmHg)等。但是,出現這些臨床表現的患者已經進展到臨床重癥階段,需要立即接受專業的監護,否則可能迅速死亡。所以,開發新的方法在早期評估哪些病例可能會成為臨床上的重癥患者是一個關鍵性問題。小編自己“理解”了一下:一般病人感到呼吸很困難才認為是重癥,如果有一種方法可以抽一管血測定一下就提前知道、提早治療,將為病人爭取更寶貴的治療時間,降低死亡率。

      5月27日,郭天南團隊在《Cell》發表了新冠肺炎研究論文,通過對65位COVID-19患者和53個對照組個體的血清進行蛋白質組學和代謝組學的分析,共鑒定并量化了894種蛋白質和941種(包括36種藥物及其代謝產物)代謝產物,并描繪了重癥患者血清蛋白質組和代謝組學的特征。

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    COVID患者血清樣本的蛋白組和代謝組分析

      該項研究基于蛋白質組學和代謝組學分析病毒感染后新冠重型患者血清中發生的獨特的分子病理變化,為新冠肺炎血清學特征表達譜提供了一個全景式的描述。同時,團隊通過機器學習,篩選出含有22個蛋白質和7個代謝物的血液生物標志物組合,建立了可區分COVID-19重型和非重型患者的蛋白質和代謝分子模型,模型準確率在訓練隊列中準確率為93.5%,兩個獨立驗證隊列準確率分別為70%和84.2%,這對新冠肺炎重癥患者早期識別與治療具有非常重要的意義。

      同時團隊也篩選獲得一組特征性變化分子,包含93種蛋白質和204個代謝物。通路分析顯示這些差異性變化分子主要富集于3個信號通路上:血小板脫顆粒、補體系統信號通路和巨噬細胞失調,該研究結果若能在更大的隊列中得到驗證,將有望為臨床醫生提供有指導意義的診斷和治療線索。在該研究的蛋白質組學分析中,團隊使用了Q Exactive HF-X輔助TMTpro 16plex標記定量蛋白質組學技術,以及TripleTOF 6600做靶向蛋白質組學多重反應監測技術(MRM-HR)。

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      據悉,目前世界各地使用組學研究COVID-19的團隊較少,除郭天南團隊,僅有德國的Markus Ralser研究組近期使用超短梯度的SWATH對COVID-19血液樣品進行了分析。

      “這項研究工作是我們團隊與臨床團隊和代謝組學研究團隊一起合作的,通過發揮三方的長處,強強聯合、跨界合作,最終完成了這篇文章?!惫炷险f到。今后團隊會繼續開發適用于各種臨床需求的蛋白質組技術和基于蛋白質檢測的臨床應用,同時聯合其他領域的科研團隊,讓生命科學的研究更加全面。

    西湖大學蛋白質組大數據實驗室

      郭天南2006年畢業于華中科技大學同濟醫學院臨床醫學七年制,同時獲得武漢大學生物科學雙學位,2012年獲得新加坡南洋理工大學博士學位,2012-2017年在瑞士蘇黎世聯邦理工大學Ruedi Aebersold教授實驗室從事博士后研究,2017年8月加入西湖大學前身任特聘研究員。在加入西湖大學之前,郭天南曾在澳大利亞悉尼大學兒童醫學研究所ProCan任Scientific Director,腫瘤蛋白質組Group Leader,悉尼大學醫學院兼聘高級講師。

      西湖大學是由施一公、饒毅、潘建偉、陳十一等七位倡議人提出并成立于2018年,施一公任首任校長。西湖大學定位“高起點、小而精、研究型”,致力于集聚一流師資、打造一流學科、培育一流人才、產出一流成果。西湖大學由西湖教育基金會舉辦,得到了各級政府和社會力量的支持,其行政制度是為了科研活動有效配置,給PI極大的自由探索的靈活度,讓PI能專注于科學研究。郭天南表示:“西湖大學給予PI們極大的信任和自主性,獨特的行政制度配合科研需求,能夠快速有效推進我們的研究?!?/p>

    實現精準醫學的路徑:快速、取樣量少、準確定量

      在生命體內,各個蛋白質就像機械鐘表的齒輪般協同合作、互相調控,從而實現一系列精密且復雜的生命活動。因此,檢測生物體中蛋白質的種類和含量,對探究生命活動的奧秘有著不可替代的重要意義。對此,郭天南表示:“我們團隊的使命是在盡可能短的時間內,從盡可能小量的生物樣本中,對盡可能多的蛋白質進行準確定量,進而解析生命活動的數學規律,最終實現基于蛋白質組的精準醫療?!?/p>

      目前,團隊主要在甲狀腺結節診斷、非靶向蛋白質組檢測、DIA張量、壓力循環技術處理活檢組織樣品四大方面進行研究,并且已經取得了一些進展。

      助力甲狀腺結節診斷,提高診斷的準確性

      甲狀腺結節是一種人群高發的疾病,從尸檢的統計報告中顯示,大約50%的人患有甲狀腺結節,目前有10%左右甲狀腺結節在體檢的時候被發現?;加屑谞钕俳Y節的患者通常會進行細針穿刺,從細胞病理學上來看大部分都是良性,很少一部分為惡性。但是,此外有大約30%的結節無法明確診斷。對于無法診斷的甲狀腺結節,大部會被手術切除,而手術后的結節通過術后細致的病理診斷后發現,大約有80%的結節屬于良性結節,在不壓迫血管神經的情況下并不需要手術切除。這也是甲狀腺癌過度診斷的原因之一。

      下面這張截圖來自2018年發表在Nature Reviews Endocrinology上的文章,該文總結了目前市面上商業使用的分子測試甲狀腺結節良惡性試劑盒的效果。這些試劑盒的靈敏度達到83%~100%,但是特異性只有10%~52%。這里的特異性是指:被診斷為惡性腫瘤的人群中,只有10%~52%的患者真正患有惡性腫瘤。也就是說,許多只患有良性結節的患者,他們的甲狀腺仍舊被切除了。

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      對此,郭天南表示:“為了解決這一問題,我們從蛋白質角度進行入手。我們采集了來自于新加坡的1725個甲狀腺組織的蛋白質組,同時通過機器學習建立一個區分甲狀腺結節良惡性的模型。然后在另外三家獨立的臨床醫院的288個石蠟樣本進行模型驗證,綜合準確率高達90.62%。我們隨后在另外一家獨立的醫院進行了前瞻性的穿刺樣本驗證。最終結果顯示,我們的模型準確率大約在90%左右?!崩眠@項技術,有望協助臨床醫生提高甲狀腺結節診斷的準確性。

      微流短梯度非靶向蛋白質組檢測結合靶向蛋白質組驗證流程,降低質譜檢測蛋白質成本

      從蛋白質組學的通用技術來看,對于一種疾病,可采用標志物發現-定量-驗證的流程,但該周期一般較長、檢測成本高、臨床大批量樣本檢測穩定性不高。郭天南團隊聯合SCIEX開發了微流短梯度的非靶向蛋白質組(SWATH-MS)檢測結合靶向蛋白質組(MRM-HR)驗證的流程,并通過已經在一個200例臨床前列腺癌及前列腺增生的隊列系統評價該流程的可行性,包括:大大提高蛋白質組的檢測通量,減低蛋白質檢測的成本,更重要的是增加大批量臨床樣本檢測的穩定性。

      實例表明,團隊利用掃描速度較快的SCIEX TripleTOF6600 檢測約200例的前列腺癌和前列腺增生的組織多肽樣本,15分鐘即可有效定量到4037個蛋白質,是傳統2小時SWATH 方法鑒定到的80%的蛋白,但只需要25%的時間消耗。而對于蛋白質組學大數據更有意義的優勢在于將批次間效應(batch effect) 降低20%。

      郭天南表示:“對于大批量臨床樣本首先需經過科學的批次設計,考慮對實驗結果可能的影響因素,諸如年齡、性別、病理類型、分型和分期等,平均隨機分布到不同批次間,從而弱化批次間效應。除了不同類型的樣本引入的誤差,對于長梯度的蛋白質組方法還存在儀器誤差,尤其是液相的色譜柱對保留時間以及肽段分離的影響較大。我們的方法增加了色譜柱利用效率,就可以減弱這種批次效應?!?/p>

      DIA張量(DIA Tensor)

      目前傳統的蛋白質組分析方法需要鑒定蛋白后才可以建立機器學習模型并作臨床診斷,需要較多的分析步驟和分析時間。郭天南團隊聯合合作者開發了一種新型的分析,基于DIA的蛋白質組數據的方法和存儲格式--DIA張量(DIA Tensor),結合深度學習可以直接應用于臨床的診斷預測。新方法可以直接對原始數據分析,通過生成DIAT張量的方式并直接應用于深度學習模型,直接進行臨床預測。郭天南表示:“隨著DIA蛋白組數據的質量和數量的增加,我們可以預見本技術在臨床診斷中的潛力,為提供疾病分型診斷提供有效解決方案?!?/p>

      壓力循環技術處理活檢組織樣品,提速檢測樣品速度

      多數臨床樣本為了能夠長久保存,通常是經過福爾馬林固定、石蠟包埋的堅硬的柱狀組織,從中提取足夠的多肽是一大難題。PCT( Pressure Cycling Technology)壓力循環技術采用的是高壓到低壓來回循環的方式,使樣品在這種壓力循環的過程中得到徹底的釋放。郭天南團隊運用PCT技術處理活檢組織樣品(~0.5mg)的速度可提高一倍,只需要大約3小時即可處理16個組織樣品,從組織到多肽。平均11.25分鐘處理一個組織樣品,非常適用于高通量臨床蛋白質組學。該方法不僅適用于新鮮的組織樣品處理,也適用于石蠟塊、石蠟切片和石蠟柱,有效處理石蠟柱是團隊開發的PCT獨有特色。同先前的實驗方法相比,這種技術不需要增加任何新的或特殊的試劑。團隊進一步優化了試劑濃度后,使國產的胰酶效力毫不遜色進口產品,方法性價比非常高。

      “作為臨床應用,我們不僅使用了高通量15分鐘的高液相流速SWATH(SCIEX TripleTOF6600),測試了每天處理60個以上的復雜組織樣品的高通量蛋白質組; 而且也測試了PulseDIA (Thermo QE HFX)和16-plex TMT (Thermo QE HFX),進行了通量較低、但是高深度的蛋白質組定量。質譜方法的選擇依臨床問題和樣品而定?!惫炷闲〗Y說。

    蛋白質組學25年發展歷程

      談到蛋白質組學的發展和技術趨勢,郭天南首先簡要回顧了蛋白質組的發展歷程。

      蛋白質組學不是憑空誕生的一個新學科,而是基于一系列蛋白質的生物化學研究和多肽質譜的研究衍生發展而來的,所有這些相關學科的研究都被串起來,成為這一新學科的基石。

      1994年 “proteome” (蛋白質組)一詞首次出現在博士研究生馬克·威爾金斯博士畢業論文中。

      1997年 瑞士蘇黎世聯邦理工大學的皮特·詹姆斯在他發表于劍橋大學《生物物理學》季刊首次提出蛋白質組學(proteomics)一詞。

      1997年,人類基因組計劃進行得如火如荼,2001年,《科學》(Science)雜志和《自然》(Nature)雜志分別出版???,報道了人類基因組計劃草圖的完成,興奮地宣告解讀了人類生命的編碼的完成,并預告了蛋白質組時代的來臨。

      生命科學的中心法則清楚地表明,基因只是遺傳編碼,在生命活動中真正發揮作用的主要是蛋白質,并且蛋白質組學比基因組學要復雜得多。在人們早期研究中,發現人類基因組中的基因數(約33,000個基因)遠少于人類蛋白質組中的蛋白質數(至少200,000個蛋白質),因此,在《科學》雜志報道人類基因組計劃完成的???,華盛頓大學的斯坦利·菲爾茨(Stanley Fields)預言蛋白質組學將很快取代基因組學成為生命科學研究的焦點。不久之后,《自然》雜志的??瘎t在顯著版面報道了人類蛋白質組學組織(HUPO)的成立,并宣告生命科學正式進入蛋白質組學時代。

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    中心法則

      21世紀初,隨著色譜-質譜技術的高速發展,為蛋白質組研究注入了新的活力,比如蛋白質的鑒定、蛋白質結構的解析、靶向蛋白質定量、蛋白質降解的研究等的重大突破,都得益于色譜-質譜技術?!澳壳?,基于液相色譜-質譜聯用(LC-MS/MS)的DIA技術(data-independent acquisition,數據非依賴采集)以及單細胞蛋白質組學分析都是目前人們研究的熱點?!惫炷险f到。

    蛋白質組學面臨的挑戰

      展望未來,郭天南也提到臨床蛋白質組學面臨的一些挑戰:已經發展到一定程度的色譜-質譜技術仍有需要突破的“技術瓶頸”:如何對更小重量的組織進行深度蛋白質組分析?如何更快的進行深度蛋白質組學分析?如何進一步降低蛋白質組學分析的成本以利于多中心臨床隊列的分析?這都是未來需要解決的問題。目前面臨的挑戰包括:樣本的質量控制,數據的聯合分析,深度挖掘及解讀。

      一般認為,相較于基因組學,蛋白質組學的發展似乎有點兒慢。對此,郭天南認為主要是因為蛋白質的復雜性和多變性,完全意義上的蛋白質組學至今仍是一個科學理想,因為至今無人知道一個生物體內到底有多少蛋白質。蛋白質組學的發展在大眾看來稍落后于基因組學。

      但是隨著色譜-質譜技術在過去的20年高速發展,越來越多的生物醫學科學家的研究受益于這項技術,比如未知蛋白質的鑒定、蛋白質相互作用的鑒定、翻譯后修飾的鑒定、蛋白質結構的解析、靶向蛋白質定量、蛋白質降解的研究等。有些方法比如靶向蛋白質組學,正在走向臨床試驗。

    臨床樣本數據庫:從組織樣本到數字文件

      2015年,郭天南和當時瑞士的團隊結合壓力循環技術(PCT)和SWATH-MS技術,提出一種將臨床組織樣本轉換為單個數字文件的方法,應用該方法對樣本的蛋白組學信息進行記錄,方便研究人員對樣本信息進行反復分析和對比?!斑@一方法的提出對增加臨床樣本的利用效率具有重要意義,我們將這一研究成果發表于《Nature Medicine》,得到了當時澳大利亞以及美國相關機構的認可與支持?!惫炷险f到 。

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      活體組織檢查(biopsy)簡稱"活檢",是指應診斷、治療的需要,從患者體內切取、鉗取或穿刺等取出病變組織,進行病理學檢查的技術。這是診斷病理學中最重要的部分,對絕大多數送檢病例都能做出明確的組織病理學診斷,被作為臨床的最后診斷?;顧z取出的組織樣本一般量比較少,對于病人疾病的檢測和診斷非常重要。但每一個臨床樣本都具有其獨特性,樣本的量非常有限并且類似于組織活檢這樣的小樣本經常會在一系列檢驗分析之后被消耗殆盡。

      “針對上述問題,我們提出一種結合壓力循環技術(PCT)和SWATH-MS技術的方法,能夠將小量的組織樣本轉變成單個數字文件,該類文件基于質譜技術,記錄著樣本的蛋白組學信息,并具有快速和可重復性特點?!惫炷险f到。該方法導出的蛋白質組學圖譜文件能夠用于不同樣本之間特定蛋白質的分析、重分析、對比以進行檢測和量化。隨后,這項技術被英國曼切斯特大學Stoller Centre和澳大利亞悉尼大學醫學院ProCan所采用。ProCan計劃在5-7年內規劃運用這項技術完成7萬個腫瘤組織樣品的蛋白質組的檢測,并建立相應的生物信息數據庫,輔助精準醫療。

    未來展望

      最后,我們請郭天南展望一下質譜和組學技術的未來,他表示:

      “希望未來的質譜技術達到更高的通量,可以分析更小量的樣品,準確度更高,更好的同AI技術融合,能夠解決臨床的實際問題。

      我們非??释吹?,蛋白質組學技術能夠在3年內參與到多個臨床試驗,5年內進入臨床診療,10年內希望蛋白質組學,能夠進入千家萬戶,為實現大健康計劃貢獻獨有的力量?!?/p>

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