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  • Nature Biotechnology | 新技術 在小麥中產生定向較長片段缺失

    2020年6月30日 17:53:47 來源: iNature
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      可以使用CRISPR–Cas編輯器在植物基因組中產生短插入和缺失,但是事實證明,很難在特定目標位點可靠產生較大缺失。

      2020年6月29日,中國科學院遺傳發育研究所高彩霞團隊在Nature Biotechnology在線發表題為“Precise, predictable multi-nucleotide deletions in rice and wheat using APOBEC–Cas9”的研究論文,該研究報告了一系列APOBEC–Cas9融合誘導的缺失系統(AFIDs)的發展。 使用AFID-3在水稻和小麥原生質體(30.2%)和再生植物(34.8%)中產生的缺失大約是可預測的。該研究顯示eAFID-3,其中AFID-3中的A3A被截短的APOBEC3B(A3Bctd)取代,產生更均勻的缺失。AFID可以用于研究調控區域和蛋白質結構域,以改善農作物。

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      CRISPR–Cas9系統已廣泛應用于基因組工程。簡而言之,一個單一的指導(sg)RNA指導的Cas9核酸酶會產生染色體雙鏈斷裂(DSB),由于RuvC結構域的靈活切割,其末端可能同時變鈍和交錯。這些DSB主要通過非同源末端連接(NHEJ)進行修復,這導致頻繁的短插入和缺失(indels)。但是,這些小插入缺失的異質性使其靶向小功能調節元件和結構域(例如順式作用元件,microRNA等成為技術上的挑戰。

      有幾種策略可用于生成目標較大的缺失,但都有缺點,例如,范圍有限和所產生的缺失的不可預測性。特別是,成對的sgRNA策略需要兩個適當間隔且有活性的sgRNA,這限制了它的范圍,并經常在所需靶標之外產生長缺失。I-TevI:Cas9融合物切割目標DNA鏈并產生?33至36 bp的缺失;因此,它們的長度相對恒定,但是很難生產,因為它們需要兩個不同的識別位點,并且彼此之間有特定的距離。核酸外切酶(例如Trex2和T5)傾向于在Cas9介導的DSB的任一側隨機切除一個或多個核苷酸,從而導致一系列不可預測的缺失。

      最近開發的prime編輯器使用工程化的Cas9切口酶-逆轉錄酶融合蛋白與工程化的prime編輯指導(peg)RNA配對產生所需的缺失,插入和核苷酸取代,但還需要提高其在植物中的效率。因此,需要新的策略來在整個基因組上產生可預測的多核苷酸缺失以進行精確編輯。

      由許多胞嘧啶脫氨酶與Cas9切口酶(nCas9)和尿嘧啶糖基化酶抑制劑融合而成的胞嘧啶堿基編輯器已在許多生物中實現了C-to-T取代。當sgRNA與目標DNA鏈配對時,非目標DNA鏈會留為單鏈氣泡,這有助于胞苷脫氨酶催化C到U的堿基取代。在堿基切除修復(BER)途徑中,尿嘧啶DNA葡糖苷酶(UDG)識別U?G錯配,切除基因組DNA中產生的尿嘧啶,并形成一個無堿基位點,導致嘌呤或無嘧啶位點裂合酶(AP裂合酶)使脫氨基鏈形成切口。)。

      該研究報告了一系列APOBEC–Cas9融合誘導的缺失系統(AFIDs)的發展。 使用AFID-3在水稻和小麥原生質體(30.2%)和再生植物(34.8%)中產生的缺失大約是可預測的。該研究顯示eAFID-3,其中AFID-3中的A3A被截短的APOBEC3B(A3Bctd)取代,產生更均勻的缺失。AFID可以用于研究調控區域和蛋白質結構域,以改善農作物。


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